兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫檢測試劑盒使用說明書
使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理，來檢測兔腫瘤壞死因子α（TNF-α），只能用于研究用途，不得用于醫學診斷。
用 途： 用于兔血清、血漿及相關液體樣本中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的測定。
工作原理
本試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平。向預先包被了兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體的酶標孔中加入腫瘤壞死因子α（TNF-α），溫育；洗滌后，加入HRP標記過的腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）的濃度呈正相關。
試劑盒組成
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1 |
標準品（640ng/L） |
0.5ml |
7 |
顯色劑A液 |
6ml |
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2 |
標準品稀釋液 |
3ml |
8 |
顯色劑B液 |
6ml |
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3 |
酶標包被板 |
12孔×8條 |
9 |
終止液 |
6ml |
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4 |
酶標試劑 |
6ml |
10 |
說明書 |
1份 |
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5 |
30倍濃縮洗滌液 |
20ml |
11 |
封板膜 |
2張 |
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6 |
樣品稀釋液 |
6ml |
12 |
密封袋 |
1個 |
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標準規格酶標儀。
3． 精密移液器及一次性吸頭
4． 蒸餾水，
5． 一次性試管
6． 吸水紙
注意事項
1． 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。
3． 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。如標本中待測物質含量過高，請先用PBS稀釋一定倍數（n倍）后再按說明書操作進行測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
4． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。
5． 為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
6． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
7． 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
標本要求
1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
操作程序
1． 標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：
320ng/L （5號標準品） 120μl的原倍標準品加入120μl的標準品稀釋液
160ng/L （4號標準品） 120μl的5號標準品加入120μl的標準品稀釋液
80ng/L （3號標準品） 120μl的4號標準品加入120μl的標準品稀釋液
40ng/L （2號標準品） 120μl的3號標準品加入120μl的標準品稀釋液
20ng/L （1號標準品） 120μl的2號標準品加入120μl的標準品稀釋液
2． 分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入稀釋好的標準品50μl；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。輕輕晃動混勻，37℃溫育30分鐘。
3． 棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。
4． 每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育30分鐘。
5． 棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。
6． 每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
7． 取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
8． 測定：以空白孔調零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
9． 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應該乘以總稀釋倍數。
操作程序總結：
準備試劑，樣品和標準品
加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30分鐘
洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30分鐘
洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘
加入終止液
15分鐘之內讀OD值
計算
檢測范圍：10ng/L→400ng/L。
規格： 96T/盒
保存： 2-8℃
有效期： 6個月（2-8℃）。