一、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容
凋亡細(xì)胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL法）
細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制作用的最終環(huán)節(jié)是：細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴露出的3’-羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來(lái)。
TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由Roche公司提供
試劑1： 酶濃縮溶液（Enzyme Solution），10×濃縮液；
試劑2： 標(biāo)記溶液（Lable Solution），1×濃縮液；
試劑3： 轉(zhuǎn)化劑-POD（Converter-POD），酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型）。
自備試劑：
PBS、
雙蒸水、
二甲苯、
梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、
DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、
Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、
蘇木素或甲基綠、
DNase 1（3000 U/ml－3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。
二、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒參考操作步驟：
1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
3. PBS漂洗2次；
4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min；
5. PBS漂洗2次；
6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100μl DNase 1，反應(yīng)在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450~500nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在組織處加50~100μl DAB底物，反應(yīng)15~25℃×10min；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。
15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）。
三、 注意事項(xiàng)
1. 進(jìn)行PBS 清洗時(shí)，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。
3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。
4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。
6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 pH4.0）染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。
7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過(guò)吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。
8. 試劑保存：未打開(kāi)的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類(lèi)型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。